一、蛋白质检测的主要方法

1. 凯氏定氮法（Kjeldahl Method）

• 原理：通过测定样品中的总氮含量，乘以蛋白质换算系数（通常为6.25）估算蛋白质含量。
• 步骤：消解样品→蒸馏→滴定。
• 优点：经典方法，适用于固体、液体样品，常用于食品行业（如牛奶、谷物）。
• 缺点：耗时（需数小时）、无法区分蛋白质与非蛋白氮（如尿素）。
• 适用场景：食品质量监控、饲料分析。

2. BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）

• 原理：在碱性条件下，Cu²⁺被蛋白质还原为Cu⁺，与BCA试剂结合生成紫色复合物，在562 nm处测吸光度。
• 优点：灵敏度高（检测下限1-20 μg/mL），抗表面活性剂干扰能力强。
• 缺点：受螯合剂（如EDTA）和高浓度还原剂影响。
• 适用场景：细胞裂解液、血清、含去污剂的样品。

3. Bradford法

• 原理：考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质结合后发生颜色变化（棕色→蓝色），在595 nm处测定吸光度。
• 优点：快速（5-15分钟）、操作简单。
• 缺点：对不同蛋白质响应差异大（需使用同源标准品）。
• 适用场景：常规实验室检测、酶活性测定。

4. Lowry法（Folin-酚试剂法）

• 原理：蛋白质与Cu²⁺在碱性条件下形成复合物，进一步还原磷钼酸-磷钨酸试剂生成蓝色产物，在750 nm处检测。
• 优点：灵敏度高于Bradford法。
• 缺点：步骤繁琐，受酚类、糖类等物质干扰。
• 适用场景：纯化蛋白质的定量分析。

5. 紫外吸收法

• 原理：利用蛋白质中酪氨酸、色氨酸在280 nm处的紫外吸收特性。
• 优点：无需试剂，快速无损。
• 缺点：核酸（260 nm吸收）会干扰结果，需通过经验公式校正。
• 适用场景：纯化蛋白质溶液（如色谱分离后的样品）。

6. ELISA（酶联免疫吸附测定）

• 原理：基于抗原-抗体特异性结合，通过酶标二抗催化底物显色，定量目标蛋白。
• 优点：特异性高，可检测复杂样品中的低丰度蛋白。
• 缺点：需特定抗体，成本较高。
• 适用场景：疾病标志物检测（如肿瘤蛋白）、生物制药质控。

7. SDS-PAGE结合Western Blot

• 原理：通过电泳分离蛋白质，转膜后利用抗体进行半定量分析。
• 优点：可同时分析分子量及含量。
• 缺点：操作复杂，适用于相对定量。
• 适用场景：研究蛋白质表达水平、翻译后修饰。

二、检测项目的选择依据

1. 样品类型：成分复杂性（如是否含脂类、糖类、去污剂）。
2. 灵敏度需求：微量样品可选BCA法或荧光标记法。
3. 检测速度：快速筛查常用Bradford法或紫外吸收法。
4. 设备条件：分光光度计、酶标仪或专业设备的可用性。
5. 预算：凯氏定氮法和ELISA的成本差异显著。

三、特殊场景的检测技术

• 荧光法（如NanoOrange、SYPRO Orange）：通过荧光染料标记蛋白质，灵敏度达ng级，适用于微量样品。
• 质谱法：精确测定蛋白质分子量及含量，用于蛋白质组学研究。
• 红外光谱法：快速无损检测食品中的蛋白质含量。

四、注意事项

1. 标准品匹配：尽量选择与待测样品同源的蛋白质标准（如检测牛血清白蛋白使用BSA标准曲线）。
2. 干扰物质处理：
   • 去除脂类（有机溶剂萃取）、核酸（核酸酶消化）或还原剂（透析）。
3. 重复实验：尤其是异质性样品需多次测定取平均值。
4. 仪器校准：定期校验分光光度计波长及吸光度准确性。

五、应用领域

• 食品工业：凯氏定氮法认证蛋白质含量标签。
• 生物制药：BCA法监控纯化工艺中的蛋白回收率。
• 临床诊断：ELISA检测血清中的特定疾病标志物。
• 科研实验：Bradford法测定细胞裂解液总蛋白以标准化上样量。

六、