水溶性蛋白检测：核心检测项目详解

一、浓度测定

1. • 原理：碱性条件下蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺，与BCA试剂形成紫色复合物，于562 nm测吸光度。
   • 优点：耐受低浓度去污剂（如1% SDS）。
   • 缺点：受还原剂（如DTT）干扰，需稀释样本。
2. • 原理：考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后由红转蓝，于595 nm检测。
   • 优点：快速（5分钟）、灵敏度高（1-20 μg/mL）。
   • 缺点：易受去污剂（如Triton X-100）影响。
3. • 原理：利用色氨酸、酪氨酸在280 nm处的吸收峰。
   • 适用场景：纯化后样品，需排除核酸污染（A260/A280比值评估纯度）。

二、纯度分析

1. • 步骤：电泳分离后考马斯亮蓝或银染，观察单一条带。
   • 分辨率：可区分分子量差异＞5 kDa的蛋白质。
2. • 类型：尺寸排阻色谱（SEC，分析聚集状态）、离子交换色谱（IEX，检测电荷异质性）。
   • 优势：定量精确，自动化程度高。
3. • 特点：高分辨率、低样品消耗，适用于微量样品分析。

三、分子量测定

1. SDS-PAGE结合Marker
   • 常规方法，误差约±10%。
2. 质谱分析（MALDI-TOF/ESI-MS）
   • 精确度：可达±0.01%，适用于翻译后修饰分析。

四、结构分析

1. 圆二色光谱（CD）
   • 检测二级结构（α-螺旋、β-折叠比例）。
2. 荧光光谱
   • 分析三级结构变化（如色氨酸微环境改变）。
3. 动态光散射（DLS）
   • 测定流体力学半径，评估蛋白质聚集状态。

五、功能活性检测

1. 酶活测定
   • 方法：检测底物消耗或产物生成速率（如NADH在340 nm吸光度变化）。
2. 免疫学活性（ELISA/Western Blot）
   • 验证抗原抗体结合能力。
3. 受体结合实验（SPR/BLI）
   • 实时监测蛋白与受体相互作用动力学。

六、稳定性评估

1. 温度/pH耐受性
   • 通过浊度法（OD350）监测聚集沉淀。
2. 长期储存稳定性
   • 定期检测活性和溶解度，优化保存条件（如添加甘油或冻干）。

实验设计要点

• 标准曲线：每次实验需新鲜制备，涵盖预期浓度范围。
• 对照设置：阴性对照（缓冲液）、阳性对照（已知浓度蛋白）。
• 重复性：至少3次技术重复，确保数据可靠性。

总结