标记基因（NPTII、HLT、PMI）定性PCR检测方法

一、检测背景与目的

二、检测项目与流程

• NPTII（新霉素磷酸转移酶II）：抗卡那霉素筛选标记。
• HPT（潮霉素磷酸转移酶）：抗潮霉素筛选标记。
• PMI（磷酸甘露糖异构酶）：甘露糖代谢正向选择标记。

• DNA提取：使用CTAB法或商业DNA提取试剂盒（如DNeasy Plant Mini Kit）提取样品基因组DNA。
• DNA纯度检测：通过分光光度计（A260/A280比值1.8–2.0）判定纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性。

• 引物序列（示例，需根据实验调整）：
  • NPTII
    • 正向引物：5′-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3′
    • 反向引物：5′-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3′
    • 产物大小：~200 bp
  • HPT
    • 正向引物：5′-ATC GGC TCC TAT GGC TGT AG-3′
    • 反向引物：5′-CGT CTG TCG AGA AGC CGA AG-3′
    • 产物大小：~350 bp
  • PMI
    • 正向引物：5′-GCA CGG CGA GGA CCT ACA TA-3′
    • 反向引物：5′-TGG CGA TGG TGA TGA TCT TG-3′
    • 产物大小：~500 bp
• 特异性验证：通过NCBI BLAST比对确认引物特异性，避免与非靶标基因交叉反应。

• 反应体系（25 μL）：
  • 2× PCR Master Mix（含Taq酶、dNTPs、缓冲液）：12.5 μL
  • 正向引物（10 μM）：1 μL
  • 反向引物（10 μM）：1 μL
  • 模板DNA（50–100 ng/μL）：2 μL
  • ddH2O：8.5 μL
• 热循环程序：
  • 预变性：95°C，5 min
  • 扩增循环（35 cycles）：
    • 变性：95°C，30 sec
    • 退火：根据引物Tm值调整（NPTII：60°C；HPT：58°C；PMI：62°C），30 sec
    • 延伸：72°C，1 min/kb
  • 最终延伸：72°C，5 min

• 阳性对照：已知含有目标基因的质粒或DNA样本。
• 阴性对照：非转基因样本或无模板水。
• 内参基因（如植物actin或tubulin）：验证DNA质量与扩增有效性。

• 琼脂糖凝胶电泳：
  • 配制1.5%琼脂糖凝胶，加入DNA Marker（如100 bp Ladder）。
  • 点样PCR产物，电泳（电压：5 V/cm，时间：30 min）。
  • 凝胶成像系统观察条带，比对目标条带大小。
• 判定标准：
  • 阳性：目标位置出现清晰条带，且大小与预期一致。
  • 阴性：无条带或条带大小不符。

三、关键注意事项

1. 防污染措施：
   • 分区操作（试剂配制区、模板添加区、扩增区）。
   • 使用带UDG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）的预混液防止扩增产物污染。
2. 引物优化：若出现非特异性条带，可通过调整退火温度或引物浓度优化。
3. 物种特异性：检测前确认目标物种基因组中无内源性同源基因（如某些植物含PMI类似基因）。

四、应用场景

1. 转基因作物（如玉米、大豆）的品系鉴定。
2. 食品或饲料中转基因成分的快速筛查。
3. 环境样本中转基因生物的监测。

五、参考文献

• 引物设计参考NCBI GenBank（如NPTII：登录号V00618）。
• 《转基因植物及其产品检测通用要求》（国家标准GB/T 19495系列）。