一、核酸提取与纯化的基础流程

1. 裂解：通过物理（超声波、研磨）或化学（裂解液）方法破碎细胞膜/核膜，释放核酸。
2. 分离：利用离心柱法、磁珠法或有机溶剂（酚-氯仿）去除蛋白质、脂类等杂质。
3. 纯化：乙醇沉淀或柱层析技术去除残留抑制剂，提高核酸纯度。

• 浓度：通过紫外分光光度计（A260/A280比值）或荧光染料（如Qubit）检测。
• 完整性：琼脂糖凝胶电泳观察DNA/RNA条带是否完整（如28S/18S rRNA比值）。

二、核酸检测的重点项目及技术原理

1. 定性检测

• 原理：通过引物特异性扩增目标DNA片段。
• 应用：病原体检测（如HPV、HIV）、基因分型。
• 优势：灵敏度高、成本低。
• 局限：仅能判断目标是否存在，无法定量。

• 原理：在恒定温度下快速扩增核酸，无需热循环仪。
• 应用：现场快速检测（如新冠病毒、疟疾）。

2. 定量检测

• 原理：通过荧光信号实时监测扩增过程，结合标准曲线计算初始模板量。
• 应用：病毒载量检测（如HBV、HIV）、基因表达分析（mRNA定量）。
• 关键参数：Ct值（循环阈值）、扩增效率。

• 原理：将样本分割为微反应单元，通过终点荧光信号计数绝对拷贝数。
• 优势：无需标准曲线，适合低丰度样本（如液体活检中的循环肿瘤DNA）。

3. 结构分析

• Sanger测序：金标准法，用于短片段精准测序（如突变验证）。
• 高通量测序（NGS）：全基因组、外显子组或靶向测序，用于癌症基因筛查、病原体宏基因组分析。

• 技术：亚硫酸盐处理结合PCR或测序。
• 应用：表观遗传学研究、肿瘤早筛（如结直肠癌SEPT9基因甲基化检测）。

4. 即时检测（POCT）

• 技术：CRISPR-Cas系统（如SHERLOCK、DETECTR）结合侧向层析试纸条。
• 优势：无需复杂设备，30分钟内出结果。
• 应用：基层医疗中的传染病快速筛查。

三、检测项目的选择依据

1. 灵敏度与特异性：qPCR可检测低至1拷贝的核酸，而NGS适合未知病原体筛查。
2. 样本类型：FFPE样本需优先修复DNA片段化问题，液体活检需高灵敏度技术。
3. 成本与时效：POCT适合现场筛查，NGS则用于科研或复杂诊断。

四、质量控制与标准化

• 内参基因：qPCR中需加入管家基因（如GAPDH）避免假阴性。
• 阳性/阴性对照：确保检测体系无污染。
• 标准化流程：遵循CLSI或ISO指南（如ISO 15189）。

五、未来趋势

1. 一体化检测平台：整合提取、扩增和检测步骤（如微流控芯片）。
2. 单细胞测序：解析细胞异质性。
3. 纳米孔测序：实现便携式实时长读长测序。

结语