蛋白质含量测定方法及检测项目详解

1. 凯氏定氮法（Kjeldahl Method）

• 检测项目：总氮含量
• 原理：通过高温消解将蛋白质中的氮转化为铵盐，蒸馏后滴定测定总氮量，乘以蛋白质换算系数（通常为6.25）得到蛋白质含量。
• 应用：食品、农产品、饲料等总蛋白的法定检测。
• 注意事项：
  • 需扣除非蛋白氮（如尿素、硝酸盐）的干扰。
  • 步骤繁琐，耗时较长，需专业操作。

2. BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）

• 检测项目：总蛋白浓度
• 原理：碱性条件下，蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺，与BCA试剂生成紫色复合物，在562 nm处测定吸光度。
• 应用：细胞裂解液、血清、组织匀浆等溶液中的蛋白定量。
• 注意事项：
  • 受强还原剂（如DTT、巯基乙醇）干扰，需控制浓度。
  • 灵敏度高（0.5–2000 μg/mL），适合微量样品。

3. Bradford法（考马斯亮蓝法）

• 检测项目：总蛋白浓度
• 原理：考马斯亮蓝G-250与蛋白质的碱性氨基酸结合，颜色由棕变蓝，595 nm处检测吸光度变化。
• 应用：快速检测纯化蛋白或粗提液中的总蛋白。
• 注意事项：
  • 受去垢剂（如SDS）和碱性缓冲液影响，需优化反应条件。
  • 标准曲线需与待测蛋白种类匹配。

4. Lowry法（Folin-酚试剂法）

• 检测项目：酪氨酸/色氨酸含量
• 原理：双缩脲反应结合Folin-酚试剂显色，检测750 nm处吸光度。
• 应用：需要高灵敏度的微量蛋白检测（如酶纯化）。
• 注意事项：
  • 受硫醇类、糖类、Tris缓冲液干扰。
  • 步骤复杂，显色不稳定，需严格控制反应时间。

5. 紫外吸收法（UV Absorption）

• 检测项目：纯化蛋白浓度
• 原理：利用蛋白质中芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸）在280 nm处的紫外吸收。
• 应用：纯化蛋白溶液（如层析洗脱液）的快速测定。
• 注意事项：
  • 核酸污染（260 nm吸收）需校正（A280/A260比值法）。
  • 不同蛋白消光系数差异大，需已知摩尔吸光系数。

6. 荧光染料法（如NanoOrange、Qubit）

• 检测项目：总蛋白浓度
• 原理：荧光染料与蛋白质疏水区结合后发射荧光，强度与浓度正相关。
• 应用：极低浓度样品（ng/mL级）或微量体积检测。
• 注意事项：
  • 需专用荧光分光光度计，成本较高。
  • 染料对蛋白种类敏感，需匹配标准品。

7. ELISA（酶联免疫吸附测定）

• 检测项目：特异性抗原/抗体浓度
• 原理：利用抗原-抗体特异性结合，酶标记放大信号，显色后定量。
• 应用：复杂样品（如血液、组织液）中特定蛋白的定量分析。
• 注意事项：
  • 需高质量抗体，存在交叉反应风险。
  • 可检测低至pg/mL级目标蛋白。

8. 质谱法（Mass Spectrometry）

• 检测项目：特定蛋白质/多肽的绝对定量
• 原理：电离蛋白质后根据质荷比（m/z）分析，结合同位素标记内标定量。
• 应用：蛋白质组学研究、生物标志物发现。
• 注意事项：
  • 设备昂贵，需专业技术支持。
  • 可同时检测多种蛋白，灵敏度达fmol级。

选择检测方法的关键因素

1. 样品类型：粗提液（BCA/Bradford）、纯化样品（紫外法）、复杂基质（ELISA/质谱）。
2. 检测目标：总蛋白（BCA、Bradford）、特定蛋白（ELISA、质谱）、氨基酸组成（Lowry）。
3. 灵敏度要求：微量样品选荧光法或ELISA，常规检测用比色法。
4. 干扰物质：避免还原剂、去垢剂、核酸等对特定方法的干扰。
5. 设备与成本：快速筛查可选Bradford法，高精度研究需质谱或ELISA。