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细菌内毒素试验

发布时间：2026-01-09 11:14:31 点击数：2026-01-09 11:14:31 - 关键词：细菌内毒素试验

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细菌内毒素试验是一种用于定性或定量检测样品中细菌内毒素（主要为革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖）的体外方法，基于鲎试剂中凝固酶原与内毒素反应形成凝胶的原理。该试验是药品、医疗器械及生物制品等领域的关键质量控制项目。

细菌内毒素试验主要分为两类：凝胶法和光度法（包括浊度法与显色法）。

凝胶法

原理：鲎试剂与内毒素发生凝集反应形成凝胶。通过系列稀释的标准内毒素与样品比较，判断内毒素限量是否符合规定。
技术要点：
- 试验有效性验证：需进行鲎试剂灵敏度复核（λc，通常为0.03～1.0 EU/mL）和供试品干扰试验。干扰试验要求标准曲线中点（λ）的几何平均浓度在0.5λ～2.0λ范围内，且阴性对照无凝固。
- 样品预处理：根据样品特性，可能需调节pH（通常6.0～8.0）、稀释或灭活干扰因子（如使用β-葡聚糖阻断剂）。最大有效稀释倍数（MVD）计算公式为MVD = CL / λ，其中C为样品限值，L为样品标示浓度。
- 结果判断：将试管倒转180°，凝胶不变形为阳性。采用系列稀释法时，终点浓度应低于规定限值。

光度法

原理：
- 浊度法：检测内毒素与鲎试剂反应过程中浊度增加速率或达到预定吸光度所需时间。
- 显色法：检测凝固酶水解合成色底物（如Boc-Leu-Gly-Arg-pNA）释放的对硝基苯胺（pNA）在405nm处的吸光度变化。
技术要点：
- 标准曲线：要求相关系数|r| ≥ 0.980。曲线范围通常为0.03 EU/mL～1.0 EU/mL。
- 回收率验证：供试品溶液的内毒素回收率应在50%～200%之间，否则判定存在干扰。
- 定量计算：使用标准曲线对数-线性回归方程计算内毒素浓度。结果需满足样品各平行管间的变异系数（CV）应小于25%。

通用要点：

检测限值（L）根据给药途径、剂量及药典规定确定，单位为EU/mL、EU/mg或EU/单位医疗器械。

药品

注射剂：根据《中国药典》、《USP》及《EP》规定。
- 非鞘内注射：限值 L = K / M，其中K为人每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量（非放射性药品：5.0 EU/(kg·h)；放射性药品：2.5 EU/(kg·h)；鞘内注射：0.2 EU/(kg·h)）。M为人每公斤体重每小时最大给药剂量。例如，静脉注射剂通常需<0.25 EU/mL（基于成人70kg，单剂1mL/h计算）。
- 注射用水：限值通常为0.25 EU/mL。
生物制品（如疫苗、血液制品）：要求更严格，常规定单个样品及批次总内毒素负荷上限。

医疗器械

分类检测：根据ISO 10993-12和ISO 11737-2标准。
- 与循环血液接触器械（如导管、透析器）：常要求<0.5 EU/mL（浸提液）。
- 植入器械：根据接触时间（≤24h， >24h至30d， >30d）分级设定限值，通常范围在0.5～20.0 EU/器械之间。
- 浸提方法：通常使用无热原生理盐水或注射用水，按表面积（如3 cm²/mL）或重量（如0.1 g/mL）比例，在37℃下浸提1小时。

透析液

凝胶法仪器

光度法仪器

原理：
- 动态浊度法：在340nm～660nm波长下，连续监测反应液浊度上升至预定阈值的时间，内毒素浓度与时间对数成反比。
- 动态显色法：在405nm波长下，连续监测pNA释放引起的吸光度上升速率，速率与内毒素浓度对数成正比。
- 终点浊度/显色法：在反应终点（固定时间）读取吸光度值。
仪器构成：
- 温控系统：多孔铝制恒温块，维持37℃ ± 0.2℃。
- 光学系统：高精度光电二极管或氙灯光源配合滤光片。
- 检测单元：通常配备16～96个独立反应管位，支持实时连续监测。
- 软件系统：自动采集数据，通过四参数或对数-线性回归拟合标准曲线，计算样品内毒素浓度、回收率、统计参数并判断有效性。
应用优势：自动化程度高，减少人为误差；宽检测范围（0.001～1000 EU/mL）；提供精确定量数据，符合GMP数据完整性要求（具备审计追踪、用户权限管理等功能）。