一、常用蛋白含量检测方法

1. 凯氏定氮法（Kjeldahl Method）

• 原理：通过消化样品将蛋白质中的氮转化为硫酸铵，再测定总氮含量，乘以换算系数（通常为6.25）推算蛋白含量。
• 优点：经典方法，成本低，适用于粗测总蛋白。
• 缺点：耗时（需数小时）、无法区分蛋白与非蛋白氮（如核酸、尿素）。
• 应用：食品工业（如乳制品、谷物蛋白含量检测）。

2. BCA法（Bicinchoninic Acid Assay）

• 原理：蛋白质在碱性环境下将Cu²⁺还原为Cu⁺，与BCA试剂形成紫色复合物，在562 nm处测定吸光度。
• 优点：灵敏度高（检测限0.5-20 μg/mL），抗干扰能力强（耐受部分去垢剂）。
• 缺点：受还原剂（如DTT）和高浓度螯合剂干扰。
• 应用：细胞裂解液、血清等复杂样品的蛋白定量。

3. Lowry法

• 原理：结合双缩脲反应（铜离子络合）和Folin-酚试剂显色，在750 nm处检测。
• 优点：灵敏度高于Bradford法（1-100 μg/mL）。
• 缺点：步骤繁琐，受去垢剂（如SDS）、糖类和Tris缓冲液干扰。
• 应用：纯化后蛋白溶液的定量分析。

4. Bradford法

• 原理：考马斯亮蓝G-250与蛋白结合后由棕红色转为蓝色，595 nm处检测。
• 优点：快速（5分钟）、操作简便，适合高通量检测。
• 缺点：易受去垢剂（如Triton X-100）和碱性缓冲液干扰。
• 应用：蛋白纯化过程中的即时浓度监测。

5. 紫外吸收法（A280法）

• 原理：利用酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）在280 nm处的紫外吸收特性。
• 优点：无需试剂、无损检测，适合纯蛋白溶液。
• 缺点：核酸污染（A260/A280>1.5提示污染）、需已知消光系数。
• 应用：纯化后抗体或重组蛋白的快速定量。

6. ELISA（酶联免疫吸附测定）

• 原理：抗原-抗体特异性结合，通过酶标记物显色定量目标蛋白。
• 优点：高特异性（检测特定蛋白）、灵敏度达pg级。
• 缺点：需特异性抗体，开发周期长。
• 应用：血清标志物（如肿瘤标志物AFP）检测。

7. SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色

• 原理：电泳分离蛋白后染色，通过灰度分析半定量。
• 优点：可视分子量、评估纯度。
• 缺点：半定量、耗时（需电泳及染色）。
• 应用：蛋白纯度验证及相对表达量分析。

8. 质谱定量法

• 原理：通过特征肽段的质量与丰度精确计算目标蛋白含量。
• 优点：超高精度、可区分翻译后修饰。
• 缺点：设备昂贵、需专业操作。
• 应用：复杂样本（如血浆）中低丰度蛋白的绝对定量。

二、方法选择的关键因素

1. 样品类型：复杂样本（如细胞裂解液）优选BCA法；纯化蛋白可选A280法。
2. 灵敏度需求：超低浓度（pg级）用ELISA；常规检测（μg级）用Bradford法。
3. 干扰物质：含去垢剂样品避免Lowry法；含还原剂样品慎用BCA法。
4. 通量与成本：高通量筛选推荐Bradford法；预算有限时可选凯氏定氮法。

三、注意事项

1. 样品处理：避免反复冻融，添加蛋白酶抑制剂防止降解。
2. 标准品匹配：标准蛋白应与待测样品来源一致（如用BSA标定抗体可能导致偏差）。
3. 对照设置：包括空白对照与内参（如β-actin），确保数据可靠性。
4. 干扰物排除：高盐样本需透析，脂质样本需离心预处理。

四、