不溶性微粒测定技术

不溶性微粒测定系指对溶液型注射液、无菌原料药、医用器械及包装材料、高纯化学试剂等产品中存在的肉眼不可见的微小颗粒进行计数与尺寸分析的技术。该检测是评价产品洁净度、生产工艺控制水平及临床用药安全性的关键指标。

1. 检测项目分类及技术要点

1.1 检测项目分类

• 尺寸与数量：测定单位体积或单位面积内，粒径大于或等于规定尺寸（如≥10μm、≥25μm）的微粒数量。

• 粒径分布：分析不同粒径区间（如2-5μm、5-10μm、10-25μm、≥25μm）的微粒数量分布情况。

• 微粒性质鉴别（辅助项目）：通过显微镜法、光谱法等对微粒的形态、化学组成（如纤维、橡胶屑、结晶、金属屑等）进行鉴别。

1.2 主要技术方法及要点
A. 光阻法（光遮蔽法）

• 原理要点：微粒通过狭窄检测区时，遮挡光束，引起光电传感器信号变化，信号幅度与微粒投影面积成正比，从而计数并测定粒径。

• 技术要点：

  • 校准：必须使用经认证的标准粒子（如ISO 21501-2或GB/T 29024.3）对仪器进行校准，确保粒径阈值和计数准确性。

  • 流速控制：采用精密的 syringe pump 或真空泵，确保样品以恒定流速通过传感器。典型流速为10 mL/min至100 mL/min。

  • 样品处理：避免引入气泡，样品需适度脱气。样品瓶需经超纯水冲洗确认无污染。

  • 浓度限值：样品微粒浓度需在仪器的“重合误差极限”以下（通常<10000个/mL），过高需用洁净液体稀释。

  • 背景扣除：测定前需对所用溶剂（通常是经0.22μm或更细滤膜过滤的纯水或溶剂）进行本底测试并自动扣除。

B. 显微计数法

• 原理要点：将样品过滤在格栅滤膜上，经干燥后在显微镜下人工或通过图像分析系统观察、计数并测量粒径。

• 技术要点：

  • 膜过滤：使用孔径不大于1.0μm的格栅滤膜（常为混纤膜或聚碳酸酯膜）。过滤装置需密闭、防污染。

  • 样品量：通常过滤不少于25mL的检品，或过滤至获得适量可计数的微粒。

  • 显微观察：使用 calibrated 目镜测微尺和物镜测微尺校准。通常采用100倍放大进行计数，必要时用400倍放大进行鉴别。

  • 计数规则：遵循“尺蠖原则”扫描整个滤膜有效面积。粒径以微粒的最长径计。

C. 电阻法（库尔特原理）

• 原理要点：微粒通过小孔时，引起两侧电极间电阻瞬态变化，脉冲幅度与微粒体积成正比。

• 技术要点：主要适用于电解质溶液中的微粒计数，需根据粒径选择合适孔径的管子。易受高浓度样品或导电粒子聚集影响。

2. 各行业检测范围的具体要求

2.1 药品领域（核心遵循药典）

• 中国药典 (ChP)、美国药典 (USP)、欧洲药典 (EP) 规定对小容量注射液（≤100 mL）和大容量注射液（>100 mL）的检查法。

  • 光阻法示例（ChP 0903）：

    • 标示装置 ≤ 100 mL 的静脉注射液：每1mL中含≥10μm的微粒不得过600粒，含≥25μm的微粒不得过60粒。

    • 标示装置 > 100 mL 的静脉注射液：每1mL中含≥10μm的微粒不得过25粒，含≥25μm的微粒不得过3粒。

  • 显微计数法：作为仲裁方法或光阻法不适用的样品（如黏度较高、易析出结晶、非水溶剂等）。

• 注射用无菌粉末及原料药：需用适宜的溶剂溶解后，按相应注射液标准检查。

2.2 医疗器械领域

• 输液、输血、注射器具 (如 YY/T 1556, ISO 8536-4)：测定最终冲洗液中的微粒。要求通常严于药品，例如：≤ 1 mL 的器具，平均每件含≥5μm的微粒数需≤100个，≥10μm的微粒数需≤20个；> 1 mL 的器具，平均每毫升洗脱液中含≥5μm的微粒数需≤100个，≥10μm的微粒数需≤20个。

• 眼科器械、植入物：相关标准（如ISO 16672, ISO 11979）对冲洗液或浸提液中的微粒有严格限制。

2.3 生物制品与疫苗

• 除常规不溶性微粒检查外，尤其关注蛋白质聚集体等亚可见微粒（粒径0.1-10μm），可能采用动态光散射、微流成像等补充技术进行表征。

2.4 电子行业（超纯化学品）

• 遵循 SEMI (国际半导体设备与材料协会) 标准（如SEMI C48、SEMI C86）。

• 对用于晶圆清洗、蚀刻的酸、碱、溶剂等超高纯化学品的微粒污染控制极为严苛，通常要求检测粒径低至0.1μm或0.05μm，并使用专门为高腐蚀性、低表面张力液体设计的传感器。例如，SEMI Grade 5 (G5) 的化学品，对≥0.1μm微粒的要求可能为<100个/mL。

3. 检测仪器的原理和应用

3.1 光阻法颗粒计数器

• 核心原理：基于朗伯-比尔定律的延伸。传感器由激光光源（如635nm半导体激光）、精密流通池（通常为矩形或圆形毛细管）和光电探测器组成。微粒通过时产生与粒径相关的脉冲信号，经放大、甄别、计数后，由处理系统换算为粒径和浓度。

• 关键组件与应用：

  • 进样系统：Syringe泵（精度高，适用于小体积、高价值样品）、真空泵/压力泵（适用于在线监测或大体积样品）。

  • 传感器：不同型号覆盖不同粒径范围（如1-500μm，或0.5-25μm）。高分辨率传感器采用鞘流技术包裹样品流，使微粒单行通过，提高精度。

  • 软件系统：负责数据采集、粒径通道设置、统计分析和报告生成。符合21 CFR Part 11要求的仪器具备审计追踪、电子签名等功能。

  • 应用：药品QC实验室的常规放行检验、医疗器械冲洗液测试、过滤器的完整性测试与挑战实验、工艺用水（如WFI）的在线/离线监测。

3.2 （全自动）显微计数系统

• 核心原理：在传统显微镜法基础上，集成自动样品台、高分辨率CCD/CMOS相机和图像分析软件。系统自动扫描滤膜，捕捉图像，通过算法识别微粒，测量其投影尺寸参数（如等效圆直径、最长弦长等）。

• 关键组件与应用：

  • 硬件：电动显微镜、落射/透射光源、精密电动样品台。

  • 图像分析软件：具备强大的图像处理能力（阈值分割、形态学操作），可区分重叠粒子、滤膜背景与真实微粒，并能按预设规则（尺寸、形状、透明度）分类计数。

  • 优势与应用：提供可视化的直接证据，是光阻法的仲裁方法。尤其适用于鉴别微粒性质（通过形态初步判断材质）、分析有色溶液或高浓度样品中的微粒，以及医疗器械表面微粒的评估。

3.3 在线/在位监测系统

• 原理：基于光阻法或光散射法，将传感器直接接入生产线（如灌装线、配液系统、纯化水循环管路），进行实时、连续的微粒监测。

• 应用：无菌生产工艺（ATMPs, 生物药）的关键环境监测、制药用水系统的持续监测、终端灌装过程的粒子负荷监控。数据可集成至SCADA或Batch记录系统，实现生产全过程的质量追溯。

3.4 仪器选择与验证要点

• 选择依据：样品性质（导电性、黏度、透明度、腐蚀性）、粒径检测范围、计数浓度上限、法规符合性、数据完整性要求。

• 方法验证：需进行准确性（使用标准粒子）、分辨率（区分相近粒径粒子的能力）、计数效率、样品流速准确性、重复性和检出限/定量限的确认。日常需执行系统适用性测试（如使用标准粒子悬浮液）。