最小抑菌浓度测定试验-营养肉汤稀释法检测

最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）是抗菌药物敏感性试验中至关重要的定量指标，它定义为在特定试验条件下，能够完全抑制微生物（通常是细菌或真菌）可见生长的最低抗菌药物浓度。准确测定MIC对于临床合理选择抗生素、优化给药方案、监测耐药性趋势以及评估新抗菌药物的效力具有核心指导意义。在诸多MIC测定方法中，营养肉汤稀释法（Broth Dilution Method）因其标准化程度高、结果直观可靠、适用于需氧及兼性厌氧细菌等优点，被广泛采纳为标准方法之一，尤其适用于研究和新药开发。该方法的核心原理是将系列倍比稀释的抗菌药物溶液与营养肉汤培养基混合，定量接种待测菌株，经适宜条件培养后，通过肉眼或仪器观察，判断细菌生长被抑制的最低药物浓度。

检测项目

本试验的核心检测项目即为目标菌株对特定抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）。具体内容包括：

• 受试菌株： 明确待测细菌（或真菌）的名称、来源、菌株编号及标准质控菌株（如大肠埃希菌ATCC 25922, 金黄色葡萄球菌ATCC 29213等）。
• 受试药物： 所使用的抗菌药物名称、来源、纯度、溶剂及母液配制方法。
• MIC值： 最终报告单位为μg/mL或mg/L的定量结果。
• 质控结果： 标准质控菌株的MIC值是否符合CLSI或EUCAST等标准规定的预期范围。

检测仪器

进行营养肉汤稀释法MIC测定所需的主要仪器设备包括：

• 无菌操作设备： 生物安全柜（II级A2或B2型），用于保证操作过程的无菌环境。
• 液体处理系统： 精密移液器（单道、多道）、重复移液器、微量移液器（用于小体积加样），确保药物稀释和菌液接种的准确性。
• 培养设备： 恒温培养箱（通常设定35±2°C），提供细菌生长所需恒定温度环境。对于某些苛养菌可能需要CO2培养箱。
• 浓度梯度制备设备： 多孔板（通常是96孔U底或平底无菌微孔板）或带盖的无菌试管（用于试管稀释法）。
• 浊度测定设备： 麦氏比浊仪（McFarland Densitometer）或分光光度计，用于将菌液标准化到特定浓度（通常是0.5麦氏单位，约1-2 × 10^8 CFU/mL）。
• 观察设备： 肉眼观察孔/管内是否有浑浊生长，或使用微孔板读数仪（酶标仪）在600nm左右波长读取吸光度（OD值），进行更客观的判断（尤其对于微量肉汤稀释法）。
• 其他辅助设备： 涡旋混合器、恒温水浴锅（用于溶解或保温某些药物）、冰箱（4°C及-20°C或-80°C用于储存药物母液、培养基）、pH计（校准培养基pH值）。

检测方法

营养肉汤稀释法（以微量肉汤稀释法为例）的主要步骤：

1. 药物母液制备： 精确称量抗菌药物，用适当溶剂（如水、DMSO<5%、乙醇等，取决于药物溶解性）溶解配制成高浓度母液（通常远高于最高测试浓度），过滤除菌，分装储存于-80°C或更低温度。
2. 药物稀释液制备： 试验当天取出母液解冻。在无菌微孔板（或试管）的第一列（最高浓度孔）加入含双倍浓度药物的肉汤培养基，然后进行系列倍比稀释（通常是2倍稀释），每孔体积通常为50μl或100μl（微孔板），最终得到一系列浓度递减的药物稀释液。最后一列（或管）不含药物，为生长对照。
3. 菌液制备与标准化： 挑取待测菌纯培养物接种于合适肉汤（如CAMHB - 阳离子调节Mueller Hinton肉汤），培养至对数生长期（通常4-6小时或过夜培养后转种，培养至对数期）。用无菌生理盐水或肉汤调节菌液浊度至0.5麦氏标准（约1-2 × 10^8 CFU/mL）。
4. 接种： 将标准化菌液用肉汤进一步稀释至最终接种浓度（通常为5 × 10^5 CFU/mL）。用移液器向含药物稀释液的各孔（或试管）中加入等体积（50μl或100μl）的稀释后菌液。此时，药物被等体积稀释，浓度变为测试浓度（1倍），每孔（管）最终接种菌量约为5 × 10^4 CFU（对于微孔板50μl+50μl体系）。同时设置阴性（无菌）对照孔（只加肉汤）和阳性（无药生长）对照孔。
5. 培养： 将接种后的微孔板（或试管）盖好，置恒温培养箱中培养16-24小时（具体时间取决于菌种和标准要求）。
6. 结果判读：
   • 肉眼判读： 取出板/管，在明亮背景下肉眼观察。与不含药物的生长对照孔（应明显浑浊）相比，肉眼观察无任何可见细菌生长的最低药物浓度孔即为该药物的MIC值。
   • 仪器判读： 使用酶标仪读取各孔在600nm左右波长的OD值。MIC通常定义为OD值显著低于生长对照（通常低于对照的10%或符合特定标准的吸光度值）的最低药物浓度。

检测标准

营养肉汤稀释法测定MIC必须严格遵守国际或国家认可的标准操作规程（SOP）和指南文件，以保证结果的准确性、重现性和可比性。主要参考标准包括：

• CLSI M07 文件： 美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute）发布的《Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard》。这是该领域最具权威性和应用最广泛的标准之一，详细规定了培养基（推荐使用CAMHB）、接种物制备、药物稀释方案、培养条件和判读方法等。
• EUCAST标准： 欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing）发布的文件（如EUCAST definitive document E.DEF 7.3.1等）。EUCAST方法在某些细节（如某些菌种推荐培养基、接种浓度、培养时间、折点定义等）可能与CLSI略有差异，在（尤其欧洲）广泛使用。
• ISO标准： 国际标准化组织（International Organization for Standardization）发布的ISO 20776-1:2019《Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems - Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices - Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases》，为国际通用的参考方法标准。
• 国家药典： 如《中华人民共和国药典》通则中也可能包含相关指导原则。

遵循这些标准至关重要，特别是对培养基成分（阳离子含量、pH值）、接种物浓度、培养时间和温度、质控菌株的使用及其MIC预期范围的规定。任何偏离标准操作都可能影响MIC结果的可靠性，进而影响临床决策或研究。