体外皮肤致敏-直接多肽结合法（DPRA）检测概述

体外皮肤致敏-直接多肽结合法（Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA）是一种基于化学反应的体外检测方法，用于评估化学物质或化妆品成分的皮肤致敏潜力。该方法通过模拟致敏物质与皮肤蛋白质中关键氨基酸（如半胱氨酸和赖氨酸）的共价结合过程，预测其致敏性。DPRA的提出旨在替代传统动物实验（如局部淋巴结试验LLNA），符合现代毒理学“3R原则”（减少、优化和替代动物实验）的要求，已被国际组织如经济合作与发展组织（OECD）正式收录为检测指南（OECD TG 442C）。

DPRA的核心原理是：致敏原通常为亲电性物质，能够与皮肤蛋白中的亲核氨基酸残基（如半胱氨酸的巯基或赖氨酸的氨基）发生共价结合，形成稳定加合物。通过体外模拟这一反应，定量测定化学物质与合成多肽的结合率，可有效预测其致敏能力。该方法具有操作简便、成本低、结果重复性高等优势，广泛应用于化妆品、药品及工业化学品的早期安全性评估。

检测项目

DPRA检测的核心项目包括以下内容：

1. 多肽结合率测定：通过分析化学物质与半胱氨酸多肽（Ac-RFAACAA-COOH）和赖氨酸多肽（Ac-RFAAKAA-COOH）的结合程度，计算反应后游离多肽的减少量；
2. 反应动力学研究：监测不同时间点下的结合速率，评估反应动态过程；
3. 浓度依赖性分析：测试不同浓度受试物对多肽消耗的影响，建立剂量-效应关系；
4. 化学物质反应性分类：根据结合率结果将物质分为强致敏原、弱致敏原或非致敏原。

检测仪器

DPRA检测需依赖以下关键仪器设备：

1. 高效液相色谱仪（HPLC）：配备紫外检测器或荧光检测器，用于分离和定量反应前后的多肽；
2. 质谱仪（MS）：必要时用于确认加合物结构；
3. 紫外-可见分光光度计：测定多肽浓度及反应体系的稳定性；
4. 恒温振荡培养箱：控制反应温度（通常为25°C±2°C）并提供均匀混合条件；
5. 超纯水系统：确保实验用水符合痕量分析要求。

检测方法

DPRA的标准操作流程分为以下步骤：

1. 样品制备：将受试物溶解于适当溶剂（如乙腈/磷酸盐缓冲液），浓度通常设置为100 mM；
2. 反应体系建立：将受试物与多肽溶液按比例混合（建议终浓度比为10:1），同时设置空白对照；
3. 孵育反应：在避光条件下于25°C振荡孵育24小时；
4. 终止反应：加入酸性溶液（如甲酸）终止反应并沉淀未反应物质；
5. 分析检测：使用HPLC测定游离多肽的峰面积，通过标准曲线计算剩余多肽浓度；
6. 数据处理：按公式计算多肽消耗百分比：消耗率(%)=[(C0-Ct)/C0]×100%，其中C0为对照浓度，Ct为反应后浓度。

检测标准

DPRA的实施需严格遵循国际公认的标准规范：

1. OECD测试指南442C：详细规定实验设计、验证标准及数据解释规则；
2. 欧盟REACH法规：认可DPRA作为化学品注册的替代方法；
3. ISO 19017:2021：提供化学品皮肤致敏体外测试的通用技术指南；
4. GLP规范：要求实验过程符合优良实验室规范，确保数据可追溯性和可靠性。
需特别注意的是，当受试物在HPLC分析中产生干扰峰时，需通过质谱验证或改用荧光标记多肽以提高检测特异性。