猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测：关键技术与应用

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS），又称"蓝耳病"，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的病毒性传染病。该病毒主要导致母猪繁殖障碍（如流产、死胎、木乃伊胎、弱仔）以及各年龄段猪（尤其是仔猪）的呼吸道疾病，造成巨大的经济损失。核酸检测因其高度的敏感性和特异性，已成为PRRSV早期诊断、流行毒株监测、疫苗效果评价及净化方案实施的核心技术手段。它能直接检测病毒核酸（RNA），在感染早期甚至在临床症状出现前即可检出病原体，为精准防控提供关键依据。

检测项目

PRRSV核酸检测主要涵盖以下关键项目：

1. PRRSV抗原检测： 定性或定量检测临床样本（如血清、肺脏、脾脏、淋巴结、精液、口腔液）中是否存在PRRSV特异性核酸片段，确定病毒感染状态。

2. PRRSV基因分型： * 型别鉴定： 区分欧洲型（Type 1, Genotype 1）和北美型（Type 2, Genotype 2），这对了解流行毒株背景、选择合适疫苗至关重要。 * 谱系/亚型分析： 在北美型内部进一步区分高致病性PRRSV（HP-PRRSV）毒株、经典毒株及不同的谱系（如Lineage 1, Lineage 5, Lineage 8等），有助于追踪疫情来源和评估毒株变异情况。

3. 混合感染检测： 可同时检测PRRSV与其他常见猪病病原体（如猪圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、细菌等），鉴别混合感染。

4. 病毒载量定量： 通过实时荧光定量PCR测定样本中的病毒核酸拷贝数，评估病毒血症水平、疾病严重程度、免疫应答效果及排毒情况。

主要检测仪器

PRRSV核酸检测依赖于一系列精密的实验室仪器：

1. 核酸提取设备： * 高速冷冻离心机： 用于样本预处理和核酸沉淀。 * 核酸提取仪： 自动化提取病毒RNA，提高效率和一致性（常用基于磁珠法或柱式法的自动化平台）。

2. 聚合酶链式反应（PCR）核心仪器： * 普通PCR仪： 用于常规RT-PCR扩增，结合凝胶电泳进行结果判读（主要用于分型或非定量检测）。 * 实时荧光定量PCR仪： 核酸检测的核心设备。用于RT-qPCR（反转录-实时荧光定量PCR），可在扩增过程中实时监测荧光信号，实现靶基因的定性和绝对/相对定量。具备多通道检测能力，可进行多重PCR。

3. 凝胶成像系统： 用于观察和记录普通PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后的结果，判断条带大小和特异性。

4. 超微量分光光度计/荧光计： 用于测定提取的RNA浓度和纯度（A260/A280比值）。

5. 基因测序仪： 用于对PCR产物进行测序，用于病毒分型、谱系鉴定、遗传进化分析和变异监测。

核心检测方法

PRRSV核酸检测的主流方法是基于PCR技术的分子生物学方法：

1. 反转录-聚合酶链式反应： * 常规RT-PCR： 首先利用反转录酶将病毒RNA逆转录为cDNA，然后利用特异性引物对目标基因片段进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳观察预期大小的扩增条带来判断结果。此方法成本较低，但敏感性、特异性和定量能力不如荧光定量PCR，且步骤较多易污染。

2. 反转录-实时荧光定量PCR： * 原理： 是目前最常用、最灵敏、最特异的PRRSV核酸检测方法。在RT-PCR反应体系中加入荧光标记的探针或染料（如TaqMan探针、SYBR Green染料）。随着扩增的进行，荧光信号累积，仪器实时监测荧光强度。通过荧光信号达到设定阈值时的循环数（Ct值）来定量起始模板量。Ct值越低，表示样本中病毒核酸含量越高。 * 特点： 闭管操作，污染风险低；灵敏度高；特异性强（尤其是探针法）；可精确定量；通量高，速度快。

3. 巢式/半巢式RT-PCR： 使用两对引物进行两轮扩增，可进一步提高检测的灵敏度，常用于极低病毒载量样本或复杂样本的检测。

4. 基因测序： 对扩增的特定基因片段（如ORF5基因编码主要囊膜蛋白GP5，是重要的分型和变异分析靶标）进行序列测定，用于精确分型、谱系划分、毒株同源性分析和分子流行病学研究。

5. 环介导等温扩增： 在恒定温度下进行核酸扩增，无需PCR仪，适合现场或基层快速筛查，但其应用广度和成熟度目前不如RT-qPCR。

检测标准与规范

为确保PRRSV核酸检测结果的准确性、可靠性和可比性，需遵循国内外相关标准、规范和指南：

1. 国际标准： * 世界动物卫生组织标准： WOAH (原OIE) 《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中提供了PRRSV检测（包括病毒分离、血清学、RT-PCR）的参考方法和指南。

2. 国家标准： * 中华人民共和国国家标准： * GB/T 18648-2020 《非洲猪瘟诊断技术》中虽然主体是ASF，但其关于核酸提取和PCR实验室操作规范具有参考价值。 * 专门针对PRRSV的国家标准正在不断完善中，行业内主要参考农业农村部发布的相关技术规范或行业标准。 * 其他国家： 如美国的USDA APHIS或相关机构也会发布技术指南。

3. 行业标准与共识： 国内外兽医诊断实验室、研究机构及大型养殖企业会制定内部的操作规程（SOP），这些SOP通常基于WOAH建议、已发表的权威文献和最佳实践，并包含：

4. 实验室质量管理体系： 遵循ISO/IEC 17025《检测和校准实验室能力的通用要求》或类似标准建立质量体系，涵盖人员、环境、设备、试剂、方法验证/确认、样本管理、结果报告、质量控制（阴阳性对照、内参基因、标准曲线等）、记录保存等全方位要求。

5. 方法验证与确认： 对所使用的检测方法（尤其是实验室自建方法）必须进行严格的验证（如特异性、敏感性、重复性、再现性、检测限、定量限等）或确认（针对标准方法）。

6. 生物安全规范： 严格遵守实验室生物安全相关规定（如GB 19489），防止病原泄漏和人员感染。

选择和使用经过验证、性能可靠、符合标准的引物探针组合（通常针对PRRSV高度保守的基因区域如ORF6/ORF7，或分型区域如ORF5）是保证检测结果准确性的核心要素之一。

综上所述，猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸检测是一项技术成熟、应用广泛的关键诊断技术。通过选用合适的检测项目、精密的仪器设备、标准化的检测方法（特别是RT-qPCR）并严格遵循国内外标准和规范，可以有效实现对PRRSV感染的快速、灵敏、特异诊断和定量分析，为猪场PRRS的有效防控、净化及保障养猪业的健康发展提供强大的科学支撑。