流行性溃疡综合征（EUS）检测

流行性溃疡综合征（Epizootic Ulcerative Syndrome, EUS），又称红点病（Red Spot Disease），是一种严重危害淡水及半咸水鱼类的传染性真菌性疾病，主要由侵袭性丝囊霉菌（*Aphanomyces invadans*）感染引起。该病以体表出现深度溃疡、坏死灶及伴随系统性炎症反应为特征，可导致养殖鱼类大规模死亡，对水产养殖业造成巨大经济损失。及时、准确的实验室检测是防控EUS的关键环节，有助于早期诊断、隔离病鱼、实施针对性治疗并控制疫情扩散。

检测项目

EUS 检测的核心项目聚焦于病原体的确认及组织病理学变化，主要包括：

• 病原体检测：直接检测或分离鉴定致病真菌*丝囊霉菌（Aphanomyces invadans）*。
• 组织病理学检查：观察病鱼组织（尤其是肌肉和皮肤溃疡边缘）的病变特征，如肉芽肿形成、菌丝侵入和坏死。
• 临床观察评估：记录典型的临床症状（如体表深部溃疡、红点、鳞片脱落、厌食、游动异常等）。

检测仪器

进行EUS精准检测需要借助多种实验室仪器：

• 光学显微镜：用于湿片压片法直接观察组织样本中的菌丝形态，或观察组织切片中的病理变化和菌丝特征。
• 组织病理学设备：包括组织处理仪（脱水、透明、浸蜡）、切片机、染色机等，用于制备组织学切片（通常进行H&E染色和特殊真菌染色如PAS或GMS）。
• 分子生物学仪器：
  • PCR仪（聚合酶链式反应仪）：用于扩增病原真菌的特异性基因片段。
  • 电泳系统（凝胶电泳槽、成像系统）：用于分析PCR产物。
  • (可选)实时荧光定量PCR仪：用于更灵敏、定量的病原DNA检测。
• 微生物培养设备：
  • 恒温培养箱：用于在特定培养基（如GP琼脂）上尝试分离培养*丝囊霉菌*。
  • 生物安全柜：确保无菌操作。

检测方法

EUS 的实验室诊断主要采用以下方法，常需结合使用以提高准确性：

1. 临床检查与样本采集：
   • 观察活鱼或新鲜死鱼的临床症状，重点检查溃疡部位。
   • 用无菌器械采集溃疡边缘（含病变与正常组织交界处）的深层肌肉/皮肤组织样本。
   • 同时采集内脏器官（如肾、脾、肝）样本用于分子检测或病理检查。
2. 湿片压片显微镜检查：
   • 取一小块溃疡边缘组织，置于载玻片上，滴加无菌生理盐水或乳酸酚棉蓝染色液。
   • 盖上盖玻片，轻轻压平，直接在光学显微镜（低倍镜到高倍镜）下观察寻找典型的、无隔或稀疏分隔的、纤细的*丝囊霉菌*菌丝（直径约10-20 μm）。
3. 组织病理学检查：
   • 将组织样本固定（常用10%中性福尔马林），脱水、包埋、切片。
   • 进行常规H&E染色和特异性真菌染色（如PAS或GMS）。
   • 显微镜下检查特征性病变：肌肉组织大面积凝固性坏死，周围环绕由巨噬细胞和淋巴细胞组成的肉芽肿炎症带，病灶内或边缘可见侵入的无隔/稀疏分隔菌丝。真菌染色可使菌丝更清晰可见。
4. 病原分离培养：
   • 尽管*Aphanomyces invadans*在常规培养基上生长缓慢且难以纯化，但仍可在特定培养基（如含抗生素的GP琼脂）上尝试培养。
   • 在25-30°C下培养，观察菌落形态（初期呈绒毛状白色），并用显微镜观察菌丝和孢子囊等结构进行初步鉴定。通常需要分子方法确认。
5. 分子生物学检测（PCR）： 这是目前最快速、特异且灵敏的诊断金标准。
   • 从病变组织中提取总DNA。
   • 使用针对*Aphanomyces invadans*的特异性引物（如基于ITS或18S rDNA区域设计的引物，如Aph1-F/Aph1-R或ApITS-F/ApITS-R）进行PCR扩增。
   • 巢式PCR或实时荧光定量PCR可进一步提高灵敏度和特异性。
   • 对PCR产物进行凝胶电泳分析或测序验证。

检测标准

EUS的检测应遵循国际或国家认可的标准和规范，以确保结果的可靠性和可比性：

• 世界动物卫生组织（WOAH，原OIE）手册标准：WOAH《水生动物疾病诊断手册》明确规定了EUS的诊断程序和推荐方法，将组织病理学检查和PCR检测列为关键确诊方法。成员国需按此标准报告疫情。
• 国家标准：
  • 中国：遵循国家标准如GB/T 36191《水产动物疫病检测规范》等，并参考农业农村部发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》及相应诊断技术规范（EUS被列为二类动物疫病）。具体方法标准可能体现在相关SN标准或行业标准中。
  • 其他国家：遵循各自国家水生动物卫生主管部门制定的官方检测规范。
• 实验室操作规范：严格遵守无菌操作、生物安全规范（BSL-2）、PCR防污染措施、组织病理学切片制作与判读标准、结果报告规范等。
• 结果判读标准：
  • 确诊：通常需要在病变组织中发现典型的肉芽肿性肌炎/皮炎，并满足以下至少一项：显微镜下观察到典型菌丝 + 分子检测（PCR）阳性；或PCR检测阳性（强推荐）；或成功分离培养病原体并经形态学和/或分子方法确认为*Aphanomyces invadans*。
  • 临床诊断：有典型临床症状（深部溃疡），组织病理学观察到特征性坏死和肉芽肿炎症（即使未观察到菌丝），并排除其他类似疾病（如细菌性败血症、寄生虫病）。

综上所述，针对流行性溃疡综合征（EUS）的检测是一个多步骤、多方法结合的过程。分子生物学检测（PCR），特别是针对*Aphanomyces invadans*的特异性PCR或实时荧光定量PCR，凭借其高灵敏度和特异性，已成为实验室确诊的核心手段。组织病理学检查则提供了直观的病变证据和菌丝观察的途径。标准的检测流程和严格的实验室规范是确保结果准确可靠、有效防控EUS疫情的基础。接到样本后，实验室通常可在2-3个工作日内提供初步或确诊报告。