对虾白斑病病毒核酸检测

对虾白斑病（White Spot Syndrome, WSS），是由白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）引起的一种高传染性、高致死性的病毒性疾病，被世界动物卫生组织（WOAH/OIE）列为法定报告疾病。该病对对虾养殖业造成了毁灭性的经济损失。WSSV具有潜伏期短（3-10天）、致死率高（可达100%）、传播途径多（水平与垂直传播）等特点。早期、快速、准确地检测出携带病毒的亲虾、苗种、养殖环境样本或发病个体，是防控该病、切断传播链、减少经济损失的关键环节。因此，WSSV的核酸检测已成为现代对虾养殖业健康管理、疫病监测、种苗检疫和流行病学调查的核心技术手段。

检测项目

本检测项目的核心目标是特异性检测样品中是否存在白斑综合征病毒（WSSV）的核酸（主要为DNA）。检测对象广泛，包括但不限于：
* **活体样本：** 对虾（亲虾、苗种、养殖虾）的肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、表皮等组织。
* **环境样本：** 养殖水体、底泥、饵料生物（如卤虫）、携带者或中间宿主（如蟹类）。
* **饲料及制品：** 用于评估投喂风险。
* **发病或死亡个体：** 用于确诊病因和监测疫情。

检测仪器

WSSV核酸检测主要依赖于分子生物学平台，常用仪器包括：
* **核酸提取设备：**
* 组织匀浆仪/研磨仪：用于充分破碎组织样本，释放核酸。
* 核酸自动提取仪：实现高通量、标准化、高效率的核酸提取纯化（如磁珠法、柱膜法）。
* 高速离心机：用于样本处理、离心沉淀等步骤。
* **核酸扩增与检测设备：**
* **聚合酶链式反应仪：** 即PCR仪/PCR扩增仪，是进行常规PCR或巢式PCR（nested PCR）的核心设备。 * **实时荧光定量PCR仪：** 最常用的高灵敏度、定量/半定量检测设备。能够实时监测扩增过程中荧光信号的变化，实现靶标DNA的定量分析，检测速度快、特异性强、灵敏度高（可低至几个拷贝），并可区分强毒株与弱毒株（通过Ct值或拷贝数估算）。 * **恒温水浴锅/PCR板热封仪：** 用于样本处理、试剂解冻、反应板封膜等辅助操作。 * **电泳及成像设备：**（主要用于常规PCR）
* 电泳仪：用于琼脂糖凝胶电泳。
* 凝胶成像系统：用于观察、记录和分析PCR扩增产物的电泳条带。
* **超净工作台/生物安全柜：** 提供无菌操作环境，防止样本间交叉污染和环境核酸污染。
* **微量移液器：** 精确加样的必备工具。

检测方法

WSSV核酸检测的主流方法是基于PCR技术的分子检测：
1. **样本采集与处理：** 无菌采集目标组织或环境样本，迅速置于无菌容器中，低温保存（4°C短时运输，-20°C或-80°C长期保存）。组织样本需在无菌条件下进行匀浆/研磨。
2. **病毒核酸提取：** 使用商品化的DNA提取试剂盒（柱式法或磁珠法为主），按照操作说明，从处理好的样本中提取总DNA。关键步骤包括裂解细胞/病毒、结合核酸、洗涤杂质、洗脱纯化DNA。
3. **核酸扩增（PCR）：**
* **普通PCR：** 使用针对WSSV高度保守基因组区域（如VP28, VP26, VP19, VP664等基因片段）的特异性引物进行扩增。反应体系包含模板DNA、特异性引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、Mg²⁺等。经过变性、退火、延伸的循环过程，指数级扩增目标片段。
* **巢式PCR：** 使用两对引物进行两轮扩增，第一轮扩增产物作为第二轮扩增的模板。此方法灵敏度极高，常用于极低载量病毒或复杂样本的检测，但操作繁琐且污染风险增加。
* **实时荧光定量PCR：** 是目前检测WSSV的“金标准”。在PCR反应体系中加入荧光标记的特异性探针（如TaqMan探针）或荧光染料（如SYBR Green）。探针法特异性更高，染料法成本较低但需进行熔解曲线分析以确认产物特异性。仪器实时监测荧光信号，达到设定阈值（Ct值）所需的循环数反应初始模板量，可进行绝对定量（通过标准曲线）或相对定量。
4. **结果判读：**
* **普通PCR/巢式PCR：** 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯或凝胶成像系统下观察是否出现预期大小的特异性条带，并与阳性对照、阴性对照、分子量标记（Marker）比较。出现预期条带判为阳性（WSSV核酸阳性），否则为阴性。
* **实时荧光定量PCR：** 仪器软件自动生成扩增曲线和Ct值（或定量结果）。样品扩增曲线有典型的“S”型增长且Ct值小于设定的阳性判定值（通常根据阴性对照背景和标准曲线设定，如Ct ≤ 35-40且曲线形态良好），判为阳性。可根据标准曲线计算病毒拷贝数或基因组当量。

检测标准

WSSV核酸检测需遵循国际或国家/行业认可的标准操作规程和技术规范，以确保结果的准确性、可靠性和可比性：
* **国际标准：**
* **世界动物卫生组织（WOAH/OIE）手册：** OIE Aquatic Manual (Chapter 3.1.1 White spot disease) 中详细规定了WSSV的官方诊断方法，包括基于PCR（普通PCR、巢式PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）的检测方法，包含推荐的引物探针序列、反应体系、循环参数、结果判定标准等。这是国际贸易检疫的权威依据。
* **国家标准/行业标准（以中国为例）：**
* **GB/T 15805.3-2018 《鱼类检疫方法 第3部分：对虾白斑综合征病毒(WSSV)》：** 这是中国国家标准，详细规定了对虾白斑综合征病毒的检测方法，包括临床症状观察、病理组织学检查、电镜观察、PCR检测（普通PCR）和实时荧光定量PCR检测方法、操作程序及结果判定。
* **SC/T 7202.2-2021 《对虾白斑综合征病毒（WSSV）检测规程 第2部分：核酸探针斑点杂交检测法》：** 虽然核酸探针杂交灵敏度低于PCR，但仍有其特定应用场景，该标准规范了此方法。
* **SN/T 1151 系列标准：** 出入境检验检疫行业标准，如SN/T 1151.1-2011 《对虾白斑症病毒（WSSV）检测方法 第1部分：巢式聚合酶链式反应法》等，规定了出入境检疫中WSSV的检测方法。
* **关键通用原则（无论采用哪个具体标准）：**
* **设立对照：** 每次检测必须设立阳性对照（含已知WSSV核酸的样品）、阴性对照（不含WSSV模板，如核酸提取试剂中的洗脱液或确定阴性样品DNA）和无模板对照（NTC，以水代替模板DNA），以监控实验的有效性和污染情况。
* **防止污染：** 严格分区操作（样品处理区、核酸提取区、PCR试剂配制区、PCR扩增区、产物分析区），使用带滤芯的移液器吸头，勤换手套，定期清洁实验台面和仪器。
* **质量控制：** 对检测过程进行全程质量控制，包括人员培训、仪器校准、试剂验证、环境监测等。
* **结果解读严谨：** 结合临床症状（如果有）、流行病学背景以及PCR/qPCR的具体结果（如Ct值、条带亮度、熔解曲线峰型）进行综合判断。对于弱阳性结果（如qPCR Ct值接近临界值），应谨慎处理，必要时进行复测或采用其他方法验证。

综上所述，对虾白斑病病毒（WSSV）的核酸检测技术，特别是实时荧光定量PCR，以其高灵敏度、高特异性和可定量性，已成为防控该疫病不可或缺的核心工具。严格遵守国际和国内相关标准进行操作和质量控制，是确保检测结果准确可靠、有效服务于对虾健康养殖和疫病防控的根本保障。