对虾传染性皮下和造血器官坏死病病毒核酸检测

对虾传染性皮下和造血器官坏死病（Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis, IHHN）是由传染性皮下和造血器官坏死病病毒（IHHNV）引起的一种严重威胁对虾养殖业的病毒性疾病。该病主要侵害幼虾和稚虾，可导致生长迟缓、畸形（如"侏儒综合征"）、死亡率升高，尤其在南美白对虾等经济品种中危害巨大。由于IHHNV可通过垂直传播（亲虾→卵/幼体）和水平传播（水环境、摄食病虾等）扩散，且潜伏感染普遍，建立快速、灵敏、特异的核酸检测方法对亲虾筛选、苗种检疫、疫病监测和无特定病原（SPF）种虾培育至关重要，是防控该病、保障产业健康发展的核心环节。

检测项目

IHHNV核酸检测的核心目标是检测对虾样本（包括亲虾、幼体、仔虾、幼虾、肝胰腺、鳃、肌肉等组织或其匀浆液、血淋巴）中是否存在IHHNV的特异性核酸片段。主要检测项目聚焦于病毒基因组中的特定保守区域（如非结构蛋白基因NS1或衣壳蛋白基因VP区段）。检测结果通常报告为“IHHNV 核酸检测阳性”或“IHHNV 核酸检测阴性”，必要时可进行病毒载量的定量分析。

检测仪器

进行IHHNV核酸检测需依赖一系列精密仪器，主要包括：

• 核酸提取设备： 组织匀浆仪、离心机（高速与低速）、漩涡混合器、金属浴/水浴锅、核酸提取仪（自动化）及配套试剂盒。
• 核酸扩增与检测设备：
  • 普通PCR仪： 用于常规PCR反应的热循环。
  • 实时荧光定量PCR仪 (qPCR)： 目前主流的检测设备，可进行病毒核酸的定量检测（绝对定量或相对定量），灵敏度高，特异性强，并能实现闭管操作降低污染风险，检测结果更客观准确。
  • 等温扩增设备（如LAMP仪）： 可在恒温条件下快速扩增核酸，适用于现场或资源有限条件下的快速筛查。
• 电泳与成像设备： 用于普通PCR产物的分析（凝胶电泳系统、紫外/蓝光透射仪、凝胶成像系统）。
• 辅助设备： 微量移液器（不同量程）、超净工作台/生物安全柜（防污染）、超低温冰箱（样本和试剂保存）、制冰机等。

检测方法

IHHNV核酸检测主要采用分子生物学扩增技术，常用方法如下：

1. 样品前处理： 采集代表性组织样本，在无菌条件下充分匀浆，使用商品化核酸提取试剂盒（如酚氯仿法、柱膜法、磁珠法）提取样本中的总核酸（DNA和RNA，IHHNV为单链DNA病毒，主要提取DNA）。提取过程需设置阴性对照（无核酸水）和阳性对照（已知IHHNV阳性样本或质粒）。
2. 核酸扩增与检测：
   • 常规PCR法：使用特异性引物（如设计针对IHHNV保守区域NS1的引物）在PCR仪上进行DNA扩增。反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用核酸染料染色后，在紫外灯下观察是否出现预期大小的特异性条带。
   • 实时荧光定量PCR法 (qPCR/Real-time PCR)： 目前的标准推荐方法。在PCR反应体系中加入特异性引物和荧光标记的探针（如TaqMan探针）。在qPCR仪上进行扩增，仪器实时监测并记录每个循环的荧光信号强度。根据扩增曲线（Ct值）判断样本是否阳性，并可利用标准曲线进行精确定量。该方法无需开盖，灵敏度、特异性、抗污染能力均优于常规PCR。
   • 环介导等温扩增法 (LAMP)： 设计4-6条特异性引物，在恒温（通常60-65°C）下进行核酸扩增。可通过肉眼观察反应管内焦磷酸镁沉淀的浊度变化，或加入荧光染料（如SYBR Green I）后观察颜色变化（由橙色变绿色）来判断结果。此方法快速（通常30-60分钟出结果）、设备简单（仅需恒温设备），适合现场快速检测。
   • 其他方法： 如巢式PCR（提高灵敏度，但易污染）、核酸探针斑点杂交（特异性强，但较繁琐）等，应用相对较少。
3. 结果判定：
   • PCR/LAMP： 出现预期条带或浊度/颜色变化，且阴性对照无条带/不变色、阳性对照有条带/变色，判为阳性；无预期条带/变化判为阴性。
   • qPCR： 样本出现典型的扩增曲线且Ct值小于设定的阈值（根据方法验证确定，通常≤35-40），阴性对照无扩增，阳性对照正常扩增，判为阳性；无扩增曲线判为阴性。定量结果根据标准曲线计算。