对虾白斑病（WSSV）检测技术指南

对虾白斑病（White Spot Syndrome Virus Disease, WSSVD）是由对虾白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）引起的一种高度传染性、致死性的病毒性疾病，是威胁对虾养殖业最严重的病害之一。该病传播迅速，感染率和死亡率极高，常呈暴发性流行，感染虾群可在短时间内全军覆没，造成巨大的经济损失。WSSV可感染多种对虾品种，包括凡纳滨对虾（南美白对虾）、斑节对虾、中国对虾、日本囊对虾等。因此，建立快速、准确、灵敏的WSSV检测方法，对于对虾养殖过程中的疾病监测预警、引种检疫、无特定病原（SPF）苗种筛选以及疫病防控策略的制定至关重要。早期发现和精准诊断是控制该病传播、减少损失的关键环节。

一、主要检测项目

对虾白斑病检测的核心目标是确认样品中是否存在WSSV或其特异性成分。主要的检测项目包括：

1. WSSV病毒核酸（DNA）检测：这是最常用和最可靠的检测项目，通过检测病毒基因组中高度保守的特异性基因片段（如VP28、VP664、VP26、TK基因等）来确认感染。

2. WSSV病毒抗原检测：通过免疫学方法检测虾体组织、血液（血淋巴）或分泌物中的病毒特异性蛋白（如VP28蛋白）。

3. 病理组织学检查：观察感染虾的典型病理变化，特别是甲壳表皮、皮下组织、造血组织、鳃、胃、肝胰腺等靶器官中出现的特征性核内包涵体（Cowdry A型）。

4. 临床症状观察：虽然非特异性，但典型症状（如甲壳出现直径0.5-2.0毫米的白点、停止摄食、反应迟钝、红体、在水面或池边漫游）可作为初步诊断的辅助依据。

5. 生物测定（攻毒试验）：用于验证病毒的存在和毒力，但耗时长且需要严格的生物安全条件，日常诊断较少使用。

二、常用检测仪器

WSSV的检测根据所采用的方法不同，需要用到多种实验室仪器：

1. 分子生物学仪器： * PCR仪（聚合酶链式反应仪）：用于普通PCR、巢式PCR（nested PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）扩增病毒核酸片段，是实验室核酸检测的核心设备。 * 恒温扩增设备（如恒温金属浴、水浴锅、或专用设备）：用于环介导等温扩增（LAMP）等恒温核酸扩增技术。 * 凝胶成像系统：用于观察和记录普通PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。 * 实时荧光定量PCR仪：进行qPCR检测，可实时监测扩增过程并定量病毒载量，灵敏度高，特异性强。 * 核酸提取仪：自动化提取虾组织或血淋巴中的核酸（DNA）。

2. 免疫学检测仪器： * 酶标仪：用于酶联免疫吸附试验（ELISA）结果的读取（吸光度值）。 * 侧向流免疫层析读数仪：用于快速检测试纸条（胶体金或荧光标记）的定量或半定量判读（部分高级试纸条需要）。 * 显微镜（光学显微镜）：用于病理组织切片观察包涵体和组织病变。 * 微量移液器、离心机、涡旋振荡器：样本处理过程中的基础设备。

3. 现场快速检测设备： * 便携式PCR仪/LAMP仪/恒温扩增检测仪：适用于养殖现场或基层检测点的快速核酸扩增检测。 * 免疫层析快速检测试纸条（胶体金试纸条）：无需仪器，肉眼判读结果，适合现场快速初筛。

三、主要检测方法

WSSV的检测方法主要分为三大类：

1. 分子生物学检测方法（核酸检测） * 普通PCR：灵敏度较高，特异性好，是经典方法。需进行凝胶电泳观察结果。 * 巢式PCR（nested PCR）：使用两对引物进行两轮扩增，敏感性极高，但易污染。 * 实时荧光定量PCR（qPCR）：敏感性最高（可检测到几个病毒拷贝），特异性强，可定量病毒载量（反映感染强度），速度快，闭管操作减少污染风险，是当前最推荐的标准确诊方法（OIE推荐）。 * 环介导等温扩增（LAMP）：在恒温（60-65°C）下快速（30-60分钟）扩增，灵敏度接近qPCR，可通过肉眼观察浊度或荧光染料颜色变化判读结果，特别适合现场或资源有限实验室。

2. 免疫学检测方法（抗原/抗体检测） * 酶联免疫吸附试验（ELISA）：可检测病毒抗原或抗体（如评估免疫效果）。敏感性较高，可批量检测，但操作相对复杂，需要专业仪器。 * 免疫层析法（胶体金/荧光试纸条）：操作简便快捷（10-15分钟出结果），无需特殊设备，适合现场快速筛查和大规模普查。敏感性通常低于PCR/qPCR，可能出现假阴性（感染早期或病毒载量低时）。

3. 组织病理学诊断 * 制作石蜡切片或冰冻切片，H&E染色后在光学显微镜下观察，寻找甲壳上皮、结缔组织、鳃、胃等部位的嗜酸性或嗜碱性核内包涵体，以及相应的组织坏死病变。是重要的辅助诊断方法。

4. 电子显微镜观察 * 通过透射电镜（TEM）直接观察病毒粒子形态（杆状、椭圆状），是确诊的金标准之一，但设备昂贵、操作复杂、耗时长，极少用于常规诊断。

四、检测标准

进行WSSV检测应遵循国际或国家/行业标准，以确保检测结果的准确性、可靠性和可比性：

1. 国际标准： * 世界动物卫生组织（WOAH, 原OIE）《水生动物疾病诊断手册》：规定了WSSV的参考实验室诊断方法，明确将组织病理学检查和qPCR（或经过验证的等效方法）列为推荐的确诊方法。

2. 国家标准/行业标准： * 中国国家标准（GB）： * GB/T 15805.5-2008 《鱼类检疫方法 第5部分：对虾白斑病（WSV）诊断规程》：详细规定了基于临床症状、病理组织学检查和PCR（包括单管巢式PCR）的检测流程和判定标准。 * 中国农业行业标准（SC/T）： * SC/T 7201.1-2006 《对虾白斑综合征（WSS）诊断规程 第1部分：核酸探针点杂交检测方法》(注：此方法现应用较少)。 * SC/T 7201.2-2006 《对虾白斑综合征（WSS）诊断规程 第2部分：指示生物检测法》(生物测定)。 * SC/T 7201.3-2006 《对虾白斑综合征（WSS）诊断规程 第3部分：RT-PCR检测法》(注：WSSV是DNA病毒，此标准名称可能有误，实际应为PCR)。 * SC/T 7201.4-2007 《对虾白斑综合征（WSS）诊断规程 第4部分：组织病理学诊断法》。 * SC/T 7201.5-2021 《对虾白斑综合征（WSS）诊断规程 第5部分：实时荧光定量PCR检测法》：新标准，推荐使用qPCR方法。 * 其他国家也制定有相应的国家标准。

3. 关键标准要求： * 采样规范：明确采样对象（濒死虾、刚死虾）、采样部位（鳃、游泳足、血淋巴、肝