箭毒蛙壶菌核酸检测：守护两栖生物多样性的关键防线

箭毒蛙壶菌 (Batrachochytrium dendrobatidis, Bd) 是一种对两栖动物种群构成灭绝性威胁的水生真菌病原体，尤其对箭毒蛙等珍稀物种具有致命杀伤力。该真菌通过感染宿主的角质化皮肤组织，破坏其渗透调节功能，导致心力衰竭而死亡。随着两栖动物多样性锐减，快速精准的Bd核酸检测已成为野生动物疫病防控、保护区管理和国际物种贸易监管的核心技术。核酸检测通过识别病原体特异性基因片段，能在感染早期甚至无症状阶段实现超敏检测，为制定隔离消杀、种群复壮等保护策略提供关键科学依据，对遏制两栖动物灭绝浪潮具有不可替代的作用。

检测项目

核心检测项目聚焦于箭毒蛙壶菌特异性DNA片段的定性与定量分析，主要靶标包括核糖体RNA基因的ITS1-5.8S-ITS2区域、28S rDNA基因以及EF-1α等保守基因序列。检测样本涵盖皮肤拭子（口腔、腹股沟等易感部位）、蝌蚪口器刮取物、水体沉积物及生物膜样本，同时需设置阳性对照（含Bd DNA的标准品）和阴性对照（无菌水）以确保结果可靠性。

检测仪器

检测流程需依托专业分子生物学设备体系：核酸提取阶段采用离心机、涡旋混合仪及自动化核酸提取仪（如QIAcube）；PCR扩增依赖梯度PCR仪或实时荧光定量PCR仪（如ABI QuantStudio系列）；结果分析需凝胶成像系统（常规PCR）或qPCR数据分析软件；辅助设备包括超净工作台（防气溶胶污染）、微量分光光度计（DNA浓度测定）和-80℃超低温冰箱（样本及试剂保存）。其中实时荧光定量PCR仪因其高灵敏度与定量能力成为核心装备。

检测方法

现行主流方法分为三级技术体系：

1. 实时荧光定量PCR (qPCR)：采用TaqMan探针法，使用Bd特异性引物（如Bd1a/Bd2a）和探针（如BdP1），通过荧光信号累积实现DNA拷贝数定量，检测限可达0.1个孢子当量，是OIE推荐的"金标准"；
2. 巢式PCR：通过两轮扩增提升灵敏度，适用于低载量样本，但操作复杂易污染；
3. 环介导等温扩增 (LAMP)：在恒温条件下快速扩增，配合比色法判读，适用于野外现场筛查，30-60分钟即可输出结果。

所有方法均需严格分区操作（试剂制备-样本处理-扩增区分离），并加入内参基因（如两栖动物β-actin）排除假阴性。

检测标准

国际通行的标准化框架包括：
- 采样规范：参照OIE《陆生动物诊断手册》，使用无菌人造纤维拭子垂直旋转擦拭皮肤10次，保存于70%乙醇或专用DNA稳定液；
- 引物体系：执行Boyle et al. (2004) 标准方案，qPCR退火温度设定为60℃；
- 质控要求：扩增曲线Ct值≤35且呈典型"S"型，标准曲线R²>0.98，扩增效率90%-110%；
- 结果判读：qPCR检测样本Ct值≤35判为阳性，需经熔解曲线分析或测序验证；环境样本需通过抑制试验排除PCR抑制剂干扰。实验室需通过盲样测试和能力验证维持ISO/IEC 17025认证资质。