螯虾瘟检测

螯虾瘟（Crayfish Plague），是由一种名为Aphanomyces astaci（俗称螯虾瘟疫真菌）的卵菌纲病原体引起的、对淡水螯虾（尤其是欧洲本土螯虾）具有毁灭性影响的传染病。该病被世界动物卫生组织（WOAH，原OIE）列为必须通报的疫病，并在许多国家被列为外来入侵物种或疫病进行严格管控。由于其传染性强、致死率高（可达100%），且能通过受污染的水体、设备、活体或死亡的螯虾甚至附着在鱼类、鸟类和水生植物上进行远距离传播，对本土螯虾种群构成灭绝性威胁，同时对水产养殖业和生态系统平衡造成巨大破坏。因此，建立快速、准确、灵敏的螯虾瘟检测体系，对于疫病监测预警、控制传播、保护濒危物种以及保障水产贸易安全至关重要。

检测项目

螯虾瘟检测的核心目标是确认样品（如濒死或死亡的螯虾组织、水体底泥、附着物）中是否存在病原体Aphanomyces astaci或其特异性遗传物质（DNA）。主要的检测项目包括：

1. 病原体检测：直接检测A. astaci的存在，这是确诊的金标准。

2. 临床症状观察：虽然非特异性，但典型的症状（如濒死螯虾行动迟缓、失去平衡、螯足和步足无力下垂、甲壳上出现褐色斑点或溃疡、步足基部出现白色菌丝束等）是启动实验室检测的关键依据。

3. 感染状态评估：在种群或个体水平上评估感染程度。

4. 环境样本筛查：检测水体、底泥等环境样本中的病原体DNA，用于疫源地追踪和环境风险评估。

检测仪器

螯虾瘟的现代检测高度依赖分子生物学技术，所需的主要仪器包括：

1. PCR仪（聚合酶链式反应仪）：用于扩增病原体的特异性DNA片段，是分子检测的基础设备。

2. 实时荧光定量PCR仪（qPCR仪）：在PCR扩增过程中实时监测荧光信号，不仅能定性检测（有无），还能进行定量分析（病原体载量），是目前最常用、最推荐的检测工具，具有高灵敏度和特异性。

3. 核酸提取仪/离心机：用于从螯虾组织（如腹部肌肉、鳃、步足基部）或环境样本（水样滤膜、底泥）中提取纯化DNA。

4. 电泳仪及凝胶成像系统：用于传统PCR扩增后产物的分离和可视化（如果使用终点PCR方法）。

5. 生物安全柜/超净工作台：确保实验操作在无污染的环境中进行，防止样本交叉污染和实验人员暴露。

6. 显微镜（光学/体视镜）：用于初步观察螯虾样本的临床症状和可能存在的菌丝结构（但肉眼或镜下直接观察到菌丝通常意味着感染已非常严重且濒死）。

7. 组织病理学设备（切片机、染色设备、显微镜）：用于组织学检查，观察病原体在组织内的侵染情况。

8. 恒温培养箱/摇床：用于病原体培养（如果尝试分离培养，但A. astaci的纯培养较困难且耗时）。

检测方法

螯虾瘟检测主要采用以下几种方法，其中分子生物学方法因其快速、灵敏、准确已成为主流：

1. 分子生物学检测法 (PCR/qPCR)： * 样本处理：采集濒死或刚死亡螯虾的关键组织（腹部肌肉、鳃、步足基部软组织）或环境样本（水样过滤后的滤膜、底泥）。迅速冷冻或保存在乙醇/缓冲液中运至实验室。 * DNA提取：使用商业试剂盒或标准方法（如酚-氯仿法）提取样本总DNA。 * PCR/qPCR扩增：使用特异性引物和探针（针对A. astaci的特异性基因区域，如5.8S rRNA基因的ITS区域、几丁质酶基因片段等）进行扩增。qPCR可结合荧光探针（如TaqMan探针）实现实时定量检测。该方法灵敏度极高，可在感染早期或载量低时检出，并能区分不同的基因型（如A, B, C, D, E型）。 * 结果判读：PCR通过凝胶电泳检查特定大小的条带；qPCR通过Ct值（循环阈值）和标准曲线判定阴阳性及定量。

2. 组织病理学检查法： * 取疑似感染的组织，进行石蜡包埋、切片、染色（常用HE染色或特异性真菌染色如Grocott's Methenamine Silver）。 * 显微镜下观察组织病理变化（如组织坏死、血淋巴细胞浸润）和特征性的无隔菌丝结构（粗细不均，不规则分支）。此法可作为辅助诊断，但在感染早期或菌丝量少时可能漏检。

3. 病原体分离培养法： * 将组织样本接种到选择性培养基（如PmTG培养基、GPA培养基）上。 * 在15-20°C下避光培养数天至数周。 * 观察菌落形态（棉花状、白色菌丝），显微镜下观察孢子囊和游动孢子特征进行鉴定。 * 此法耗时长（需要数周）、成功率较低（受样本新鲜度、杂菌污染等影响），主要用于菌株保藏或进一步研究，不适用于快速诊断。

4. 临床症状观察法： * 现场观察螯虾行为异常和体表病变。此法简便快捷，但特异性低，仅能作为初步怀疑的依据，必须结合实验室检测确诊。

推荐方案：对于疑似病例或例行监测，首选实时荧光定量PCR (qPCR)方法。对于qPCR阳性样本，可结合组织病理学检查进一步确认。分离培养可作为研究的补充手段。

检测标准

螯虾瘟的检测遵循国际和国内权威制定的标准规范，以确保检测结果的可靠性和可比性：

1. 世界动物卫生组织 (WOAH, 原OIE) 陆生动物诊断试验与疫苗手册： * 该手册是国际认可的权威标准，其中详细规定了螯虾瘟的诊断方法和程序。 * 明确规定qPCR（特别是基于Oidtmann et al. 2006, 2009等建立的方案）为推荐的首选诊断方法。 * 对样本采集、运输、保存、DNA提取、PCR/qPCR操作流程、引物/探针序列、结果判读标准等都有详细指导。

2. 国家/地区标准： * 许多受螯虾瘟影响的国家（如欧盟成员国、英国、挪威、美国等）以及螯虾养殖或贸易大国，都根据WOAH手册制定了本国的国家标准或行业规范。 * 中国：农业农村部发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》将螯虾瘟列为二类动物疫病。相关的检测标准和技术规范通常由全国水产技术推广总站、中国动物疫病预防控制中心或省级水生动物疫病预防控制机构发布，其主要内容和技术路线均参考或等同采用WOAH标准。

3. 科研文献与共识方法： * 在WOAH标准基础上，国际上一些被广泛验证和采纳的qPCR方法（如Oidtmann et al. 2006; Vrålstad et al. 2009, 2011）已成为实际检测工作中的黄金标准。 * 这些方法通常指定了特定的引物对和探针序列，优化了反应体系和循环条件。

总结： 螯虾瘟的有效防控依赖于快速、准确的诊断。以实时荧光定量PCR (qPCR) 为核心的分子检测技术，凭借其卓越的灵敏度和特异性，结合WOAH等国际国内标准的规范指引，构成了当前最可靠的螯虾瘟检测体系。严格的样本采集处理流程、规范的实验室操作、标准化的结果判读以及定期的实验室能力验证，是确保检测结果准确性和公信力的关键。