非洲马瘟血球凝集与血球凝集抑制试验检测的重要性

非洲马瘟（African Horse Sickness, AHS）是一种由非洲马瘟病毒（AHSV）引起的烈性传染病，主要感染马、骡、驴等马科动物，通过蚊虫等吸血昆虫传播。该病具有高致死率（可达90%以上）和快速传播的特点，被世界动物卫生组织（WOAH）列为须通报的动物疫病。在疫病防控中，实验室检测是早期诊断、疫情监测和疫苗免疫效果评估的核心手段。其中，血球凝集试验（Hemagglutination Assay, HA）和血球凝集抑制试验（Hemagglutination Inhibition Assay, HI）因其操作简便、特异性强，被广泛用于非洲马瘟病毒的抗原检测及抗体水平分析。

检测项目及原理

1. 血球凝集试验（HA）：用于检测样本中是否存在非洲马瘟病毒抗原。病毒表面的血凝素蛋白可与特定动物（如马或小鼠）的红细胞表面受体结合，导致红细胞凝集，形成肉眼可见的网格状沉淀。凝集效价越高，表明病毒浓度越高。
2. 血球凝集抑制试验（HI）：通过已知病毒抗原与待测血清中的抗体反应，评估血清中的特异性抗体水平。若血清中含有抗体，则会与病毒结合并阻止其凝集红细胞，从而抑制凝集现象，通过效价判断抗体浓度。

检测仪器与试剂

实验需配备以下核心设备与材料：
- 酶标仪或微量反应板（U型或V型）
- 微量移液器及配套吸头（10-200μL）
- 离心机（用于红细胞洗涤）
- 恒温培养箱（37℃±1℃）
- 生物安全柜（防止病毒气溶胶污染）
- 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2-7.4）
- 1%红细胞悬液（常用马或小鼠红细胞）
- 标准阳性血清与阴性对照血清

检测方法与步骤

血球凝集试验（HA）流程：
1. 样本处理：待检组织匀浆液或细胞培养物经离心取上清，灭活后备用。
2. 红细胞制备：采集健康动物抗凝血，经PBS洗涤后配成1%悬液。
3. 病毒稀释：将样本做2倍系列稀释（如1:2至1:4096）。
4. 加样反应：每孔加入等量红细胞悬液，37℃孵育1小时。
5. 结果判定：观察红细胞沉淀模式，完全凝集的最高稀释度为HA效价。

血球凝集抑制试验（HI）流程：
1. 血清处理：56℃水浴30分钟灭活非特异性抑制因子。
2. 抗体稀释：血清从1:10开始进行2倍系列稀释。
3. 加入病毒：每孔加入4单位HA效价的病毒液，37℃作用1小时。
4. 添加红细胞：加入1%红细胞悬液，孵育后观察凝集抑制情况。
5. 效价计算：完全抑制凝集的血清最高稀释度即为HI效价（如1:160）。

检测标准与质量控制

非洲马瘟HA/HI试验需遵循国际及国家标准：
- WOAH《陆生动物诊断试验手册》：规定红细胞种类、反应温度及结果判读标准。
- GB/T 22330-2008（中国国家标准）：明确样本处理、试剂配制及试验重复性要求。
- 质量控制要点：每批次实验需设置阳性对照（已知效价血清）、阴性对照（PBS）和红细胞自凝对照，确保反应体系特异性。HI效价≥1:40判定为阳性，提示动物具有免疫保护力或感染后恢复期。

结语

血球凝集与抑制试验作为非洲马瘟诊断的经典方法，兼具成本低、耗时短的优点，尤其适用于基层实验室和田间监测。随着分子生物学技术的发展，PCR等检测手段逐渐普及，但HA/HI仍是抗体水平评估和疫苗免疫效果验证的“金标准”。未来，通过标准化操作流程与自动化仪器的结合，该技术将在AHS防控中持续发挥重要作用。