核酸定量PCR检测：核心检测项目详解

一、病原体检测：精准追踪感染程度

• 病毒：如SARS-CoV-2（靶基因：ORF1ab、N基因）、HIV（病毒载量）、HPV（分型检测）等。
• 细菌：结核分枝杆菌（rpoB基因）、肺炎支原体等。
• 真菌：侵袭性念珠菌（ITS区域）。

• 咽拭子、血液、痰液、脑脊液、组织活检等。

1. 核酸提取：针对不同病原体选择DNA/RNA提取试剂盒（如病毒RNA需反转录为cDNA）。
2. 引物/探针设计：靶向病原体特异性保守区域，避免交叉反应。
3. 定量分析：通过Ct值（扩增阈值循环数）结合标准曲线计算病原体载量。

• 诊断：区分活动性感染与既往感染（如HIV病毒载量＞50 copies/mL提示需治疗）。
• 疗效监测：动态观察抗病毒治疗中病毒载量下降趋势。
• 流行病学：追踪疫情传播强度（如新冠爆发期间的病毒定量）。

二、基因表达分析：解码分子机制

• 癌症相关基因：如p53（抑癌基因）、HER2（乳腺癌靶点）。
• 炎症因子：IL-6、TNF-α等。
• 耐药基因：如EGFR T790M突变（肺癌靶向治疗耐药标志）。

1. RNA质量控制：A260/A280比值＞1.8，RIN值（RNA完整性）＞7。
2. 反转录：使用逆转录酶合成cDNA，避免基因组DNA污染。
3. 相对定量：采用ΔΔCt法，以内参基因（如GAPDH、β-actin）标准化表达量。

• 机制研究：揭示基因在疾病通路中的调控作用。
• 生物标志物挖掘：筛选预后相关基因（如高表达Ki-67提示肿瘤侵袭性强）。
• 药物开发：评估化合物对靶基因的调控效应。

三、转基因检测：保障生物安全

• 通用元件：CaMV 35S启动子、NOS终止子。
• 特定基因：如抗虫Bt基因（Cry1Ab）、耐除草剂EPSPS基因。

• 植物组织研磨后CTAB法提取DNA，食品样本需去除PCR抑制剂（如多糖、多酚）。

1. 筛查检测：确认是否存在转基因成分（定性）。
2. 品系鉴定：通过事件特异性引物区分不同转基因品系（如MON810 vs. Bt11玉米）。
3. 定量分析：计算转基因成分占总DNA的比例（欧盟阈值：0.9%）。

四、肿瘤标志物检测：指导精准医疗

• 基因突变：EGFR、KRAS、BRAF突变（指导靶向用药）。
• 融合基因：BCR-ABL（慢性粒细胞白血病）、ALK融合（非小细胞肺癌）。
• 甲基化标志物：SEPT9（结直肠癌早期筛查）。

• 组织活检（金标准）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、胸腔积液等。

• 数字PCR（dPCR）辅助：对低频突变（＜0.1%）具有更高灵敏度。
• 多重检测：同时分析多个突变位点（如肺癌EGFR 19外显子缺失/L858R/T790M）。

• 伴随诊断：筛选适合EGFR-TKI治疗的肺癌患者。
• 疗效预测：治疗后ctDNA中突变丰度下降提示治疗响应。
• 复发监测：术后ctDNA阳性预示微小残留病灶。

五、操作流程与质控要点

1. 样本预处理：
   • 血液：EDTA抗凝，离心分离血浆/白细胞。
   • 组织：液氮速冻后机械粉碎，避免RNA降解。
2. 防污染措施：
   • 分区操作（试剂准备区、样本处理区、扩增区）。
   • 使用UNG酶（防扩增产物污染）。
3. 质控品设置：
   • 内参基因（确保提取效率）、阴性对照（不含模板）、阳性对照（已知浓度标准品）。

六、未来展望